Fumaraza este o enzimă care se gasește la nivelul celulelor eucariote în matrix-ul mitocondrial, dar și la nivel citosolic. În ultimii ani cercetătorii s-au concentrat asupra investigării funcțiilor acesteia. În mod normal, fumaraza de la nivel mitocondrial, este o enzimă cu rol in ciclul acizilor tricarboxilici. Ea catalizează reacția biochimică de hidratare a acidului fumaric la acid L-malic.
La drojdii (S. Cerevisae), gena FUM1 este exprimată printr-un singur produs de translație, distribuit între citosol și mitocondrie printr-un mecanism unic. Ohad Yogev și Esti Singer de la Catedra de Microbiologie și Genetică Moleculară a Facultății de Medicină din Ierusalim, împreună cu Machal Goldberg din cadrul Catedrei de Biologie Moleculară a Cornell University (New York – SUA) au arătat că plierea rapidă a fumarazei împiedică importul moleculei în mitocondrie.
La oameni proteina este codificată de o singură genă, însă mecanismul de distribuție între citosol și mitocondrie al fumarazei umane este încă necunoscut. Studii recente arată că absența fumarazei din citoplasmă este legată de apariția unor tumori la nivel renal, în cadrul unui sindrom numit Leiomiomatoză ereditară și Cancer Celular Renal (Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer – HLRCC). Acest sindrom se caracterizează prin apariția unor carcinoame la nivelul celulelor renale și a leiomiosarcoamelor uterine. În majoritatea cazurilor de HLRCC a fost detectată o inactivare bi-alelică ceea ce a dus la apariția ipotozei conform căreia această enzimă ar putea acționa ca supresor tumoral. Mai nou se pare că inhibiția fumarazei ar duce la creșterea concentrației intracelulare de anion fumarat, care mai departe acționează ca inhibitor competitiv al prolil hidroxilazei al factorului inductibil al hipoxiei (HPH), ceea ce stabilizează factorul inductibil al hipoxiei (HIF). HIF este un factor de transcripție ce mărește expresia genelor reglatoare ale angiogenezei, precum VEGF.
Aceste observații arată existența unui mecanism indirect între procesul de formare al tumorilor și nivelul de fumarat intracelular. Cei trei oameni de știință au condus numeroase cercetări pentru a identifica rolul fumarazei, atât în cazul drojdiilor, cât și în cazul celulelor umane. Pentru identificarea enzimei citosolice la drojdii, cercetătorii au folosit o metodă de sinteză a genelor în doi pași, pentru a exprima fumaraza din genomul mitocondrial, astfel încât să existe siguranța absenței izoenzimei citosolice. Metoda presupune folosirea recombinării și transformării omologe, atat în cazul genomului nuclear cât și în cazul celui mitocondrial. S-au obținut astfel linii celulare de drojdii în care gena FUM1 a fost îndepărtată, în timp ce proteina citosolică a fost exprimată de către o versiune modificată a acestei gene numită FUM1m (obținută din genomul mitocondrial al celulei). Noua linie celulară de drojdii obținută a fost selecționată prin posibilitatea acestor celule de a crește pe un mediu de galactoză, sau pe un mediu cu surse de carbon nefermentative (glicerol), ceea ce a fost folosit ca indicator pentru funcționalitatea ciclului acizilor tricarboxilici.
Celulele modificate genetic au fost supuse unor condiții variabile de temperatură, lumină, radiații, nutrienți etc.. Cercetătorii au observat că celulele au prezentat o sensibilitate mărită la radiații din domeniul infrarosu (IR). O altă observație interesantă a fost prezența în cantitate mai mare a hidroxiureei în mediul de cultură. Radiațiile din domeniul IR determină apariția de erori la nivelul ADN dublu catenar, în timp ce hidroxiureea este o substanță inhibitoare a ribonucleotid reductazei, iar prezența sa poate determina blocarea furcii de replicare, ceea ce duce la erori în replicarea ADN. Aceste lucruri arată o susceptibilitate mărită a drojdiilor în absența izoenzimei mitocondriale.
Pentru o mai bună înțelegere a mecanismelor implicate, cercetătorii au creat linii celulare modificate genetic, atât prin absența genei FUM1m, cât și prin absența unor gene răspunzătoare de repararea ADN. Rezultatele au arătat o creștere a sensibilității materialului genetic la radiațiile UV. Cercetătorii au observat revesibilitatea la apariția unor erori la nivelul ADN, în momentul exprimării fumarazei citosolice. “Prin modificarea genei corepunzătoare de biosinteza izoenzimei citosolice, astfel încât doar un singur aminoacid de la nivelul situsului catalitic al enzimei să fie modificat, am observat inactivarea enzimei”, spune unul dintre cercetători.
Pentru a verifica dacă acidul malic, sau acidul fumaric, prezintă un rol în răspunsul la apariția de erori la nivelul ADN, cercetătorii au folosit culturi ce aveau în componență gena FUM1m, în culturi cu glucoză sau galactoza (pentru selecție), în prezența esterilor corespunzători: monoetil-fumarat sau dietil-fumarat. Prin folosirea esterilor, este facilitată preluarea lor la nivel celular, unde sunt biotransformați în acizii corespunzători.
Din datele experimentale obținute, cercetătorii au observat că fumaraza citosolică poate fi înlocuită prin complementaritate de către acidul fumaric, spre deosebire de acidul malic, prin a cărui adăugare în mediul de cultură nu au fost corectate erorile apărute la nivelul ADN-ului. Acest lucru arată că rolul fumarazei citosolice în protecția față de erorile ADN, este mediată de către activitatea sa catalitică privind formarea acidului fumaric, ceea ce este dovedit și de faptul că fumaraza umană s-a dovedit a fi activă în celulele de drojdii.
Prin expunerea celulelor microorganismelor la o cantitate mare de hidroxiuree, s-a observat folosind analiza Western blot nivelul mai mare al concentrației de fumarază. Folosind linii celulare HeLa, cercetătorii au observat că același lucru este valabil și în cazul organismelor eucariote complexe, așa cum este omul.
Pentru a susține ipoteza de mai sus cercetătorii au verificat și localizarea intracelulară a fumarazei în urma expunerii unor culturi de celule eucariote la hidroxiuree și IR (radiații infraroșii), pentru a induce degradarea ADN, iar apoi au evaluat culturile folosind microscopia confocală imunofluorescentă.
Rezultatele au arătat că în ambele cazuri (folosind atât hidroxiuree cât și IR) concentrația intranucleară a fumarazei este mai mare. S-a observat că inițial această enzimă este localizată la nivel mitocondrial și citoplasmatic, însă pe măsură ce trece mai mult timp de la inducerea degradării ADN, concentrația fumarazei din nucleul celular creștea. Aceste observații susțin ideea aceluiași rol al fumarazei, cu cel observat în cazul drojdiilor.
Studiile cercetătorilor arată rolul biologic al fumarazei citosolice, mult mai puțin caracterizată față de cea mitocondrială implicată în funcționarea ciclului acizilor tricarboxilici. Rolul acestei enzime relevă legătura dintre metabolismul primar (reprezentat de fumarază și acidul fumaric) și răspunsul celular la erorile de la nivelul ADN-ului, prin faptul că propagarea tumorilor ar putea fi controlată la nivel metabolic. Enzimele implicate în metabolism ar putea avea și alte roluri importante în diverse procese de la nivel celular.
Bibliografie:
Yogev O, Yogev O, Singer E, Shaulian E, Goldberg M, et al. (2010) Fumarase: A Mitochondrial Metabolic Enzyme and a Cytosolic/Nuclear Component of
the DNA Damage Response. PLoS Biol 8(3): e1000328. doi:10.1371/journal.pbio.1000328
| < Anterior | Urmator > |
|---|
inhibitori ai acestor enzime sunt in clinical trials parca in faze destul de avansate...